DNA納米機器是基于DNA自組裝形成的納米結構。通過嵌入多種類型的功能核酸單元，DNA納米機器可以響應腫瘤細胞內源性刺激物（如谷胱甘肽、microRNA等）而引發結構變化，實現腫瘤細胞成像或治療。然而，實體腫瘤的微環境復雜，腫瘤細胞周邊存在大量有重要功能的健康細胞（如成纖維細胞、免疫細胞等）。傳統的DNA納米機器往往會因實體瘤微環境中內源性刺激物的影響，在其進入靶向腫瘤細胞前被誤啟動，對周圍健康細胞造成毒副作用損傷。因此，開發一種在細胞水平上特異性激活的納米機器，對于腫瘤的精準治療具有重要意義。
細胞膜是隔離細胞與外部環境的天然屏障，通過核酸適配體與膜蛋白結合，可以使DNA納米機器在細胞膜表面進行邏輯運算而產生輸出信號。在前期研究中，鞠熀先與劉穎教授報道了基于核酸適配體和細胞膜上雙受體結合的“雙鎖-智能鑰匙”DNA邏輯門模型，并在腫瘤細胞識別與腫瘤治療中實現了細胞亞型特異性的區分（Nat. Commun. 2016, 7, 13580）。然而，在細胞膜表面完成“邏輯門”運算需要依賴DNA鏈在細胞膜上的遷移。這一過程依靠DNA鏈的“脫落與再結合”，效率受限，且易產生假陽性結果。為解決這一問題，該研究組設計了一種跨細胞膜進行DNA邏輯門運算的納米機器（圖1a），其兩步DNA運算分別在細胞膜上與細胞質內完成，有效避免了DNA納米探針在實體瘤微環境中的非特異性激活，實現了活體內實體腫瘤的精準光動力治療。該DNA納米機器由上轉換納米粒子內核（UCNPs）、DNA組裝體L012和H012組成（圖1b）。含sgc8適配體的DNA鏈LA-apt與癌細胞膜上過表達的PTK-7蛋白結合，構成信號輸入端1；癌細胞內高表達的miRNA-21作為信號輸入端2。這兩個信號輸入端與DNA納米機器上的L012部分共同形成“AND”邏輯門。
1. (a) DNA跨膜邏輯門運算與(b) DNA納米機器結構示意圖。(c)以LA-apt與PTK-7蛋白結合構成信號輸入端1、miRNA-21為信號輸入端2進行跨膜運算而釋放L2。(d) L2啟動循環反應恢復光敏劑活性。
DNA納米機器進行跨膜邏輯運算的過程如下：LA-apt與L012在細胞膜表面雜交，取代L1鏈后暴露miRNA-21的結合位點，并誘導納米粒子進入細胞質；細胞質中的miRNA-21與納米粒子上的L012發生鏈取代反應，輸出信號（即釋放的L2鏈）（圖1c）；釋放出的L2鏈打開UCNPs表面修飾的H1發卡，并隨后打開H2發卡重新釋放L2鏈進行下一循環。這一過程可不斷恢復光敏劑的活性，在UCNPs的綠色發射光的激發下產生活性氧，實現腫瘤細胞的光動力治療（圖1d）。
將ROS指示劑DHR123修飾在DNA納米機器上可驗證細胞內精準光動力治療。在細胞表面錨定LA-apt后，UCNPs-DNARB/BHQ孵育的MCF-7細胞在近紅外光照下有明顯的ROS產生（圖2a），而其對照物則不能被產生ROS（圖2b）。miRNA識別位點未被封閉的對照材料UCNPs-DNA'RB/BHQ與miRNA-21孵育后，在miRNA-21陰性的MCF-7細胞中顯示明顯的ROS熒光；而UCNPs-DNARB/BHQ此細胞中并沒有ROS產生（圖2c）。因此，封閉miRNA識別位點可保證光動力治療僅在腫瘤細胞內發生，避免對正常細胞組織的損傷，從而實現癌細胞的精準高效光動力治療（圖2e）。
2. (a) LA-apt和(b) LA'-apt錨定的UCNPs-DNARB/BHQ處理MCF-7細胞后的共聚焦成像。(c) LA-apt錨定miRNA-21陰性的MCF-7細胞在UCNPs-DNARB/BHQ或UCNPs-DNA'RB/BHQ處理后的共聚焦成像。(d) MCF-7對照細胞與分別不同方式處理后的MCF-7細胞的細胞存活率。(e) MCF-7對照細胞、在UCNPs-DNARB/BHQ (LA-apt+A)、UCNPs-nrDNARB/BHQ (LA-apt+B)或UCNPs-DNA (LA-apt+C)處理后的LA-apt錨定MCF-7細胞、UCNPs-DNARB/BHQ處理后(LA'-apt+A)的LA'-apt錨定細胞的細胞增殖率。
DNA納米機器進行光動力治療的效果在動物層面也得到驗證（圖3）。通過在UCNP表面與L0鏈末端分別標記Cy3以及Cy5，得到雙色納米機器UCNPsCy3-DNABHQ-Cy5，同時發卡H1末端修飾的BHQ使Cy3熒光的猝滅。通過Cy5對DNA納米機器在活體內的遞運示蹤，通過Cy3的熒光恢復顯示DNA納米機器的激活。從小鼠熒光成像可看出，盡管納米材料會部分進入肝臟，只有腫瘤處有明顯的Cy3熒光，證明該DNA納米機器的跨膜運算僅在腫瘤細胞中激活，而不會對正常器官組織造成損傷。
3. 注射LA-apt或LA'-apt、隨后UCNPsCy3-DNABHQ-Cy5或UCNPsCy3-DNA'BHQ-Cy5小鼠的(a)活體熒光成像與(b)器官和腫瘤組織成像。
上述相關成果已以“Activating DNA Nanomachine via Computation across Cancer Cell Membrane for Precise Therapy of Solid Tumors”為題于9月2日在Journal of the American Chemical Society（DOI: 10.1021/jacs.1c06361）在線發表。張玥和陳偉偉副研究員為該工作的共同第一作者，鞠熀先教授和劉穎教授為共同通訊作者。
值得一提的是，直博生張玥在該研究組攻讀博士學位期間（2015.9-2020.8）圍繞“癌癥高效精準診療中的上轉換納米探針的研制及其性能研究”取得一系性創新成果。她實現了上轉換發光驅動的DNA偶氮苯納米泵用于化療藥物的可控釋放（Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 18207-18211）和近紅外光響應microRNA放大器的早期癌癥精準光動力治療（Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 21454-21459），提出近紅外光控撕裂上轉換納米膠囊的siRNA遞運和基因治療策略（Biomaterials2018, 163, 55-66），通過近紅外光瞬間點燃上轉換納米炸彈，實現了快速藥物釋放和癌癥高效治療（J. Control. Release2021, 336, 469-479），并以共同第一作者針對siRNA運載體系存在的靶向性與siRNA穩定性問題，發展了一種時空可控的基因治療方法（ACS Nano2018, 12, 10797-10806）。
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